Вирусо-бактеральные ассоциации, верифицированные в моче здоровых людей (пилотное исследование)

Ю.Л. Набока¹, А.В. Ильяш², Д.В. Крахоткин³

¹Д.м.н., профессор; заведующая кафедрой микробиологии и вирусологии №1 ФГБОУ ВО РостГМУ Минздрава России
²К.м.н., ассистент кафедры урологии и репродуктивного здоровья человека с курсом детской урологии-андрологии ФПК и ППС ФГБОУ ВО РостГМУ Минздрава России
³Аспирант кафедры урологии и репродуктивного здоровья человека с курсом детской урологии-андрологии ФГБОУ ВО РостГМУ Минздрава России

Введение

На протяжении длительного времени считалось, что отрицательный результат культурального исследования мочи или отсутствие каких-либо уропатогенов является показателем стерильности и здоровья мочевого тракта [1]. В настоящий момент появляется все больше новых данных о том, что моча здорового человека имеет свою уникальную микробиоту и виробиоту. Это стало возможным благодаря использованию расширенных методик культурального исследования мочи в аэробных и анаэробных условиях культивирования, а также метагеномных и молекулярно-биологических методов таких как, полимеразная цепная реакция (ПЦР) в режиме реального времени, секвенирование гена 16S рРНК, cаузерн- и нозерн-блоттинг [2, 3].

В отношении характеристики качественного состава микробиоты и/или микробиома мочи имеются единичные работы. Wolfe AJ et al. с помощью пиросеквенирования и ПЦР с праймерами направленными на гипервариабельные V1-V3 субрегионы эубактериальной 16S рРНК в средней порции мочи выявляли Lactobacillus, Actinobaculum, Aerococcus, Anaerococcus, Atopobium, Burkholderia, Corynebacterium, Gardnerella, Prevotella, Ralstonia, Sneathia, Staphylococcus, Streptococcus, Veillonella как у здоровых женщин, так и с пролапсом тазовых органов или ургентным недержание мочи [4].

Nelson DE et al. в своём исследовании показали присутствие облигатных и/или факультативных анаэробов в моче здоровых юношей [5]. Данные литературы относительно вирусных патогенов, верифицированных в моче и/или слизистой мочевого пузыря, или в других отделах мочевых путей в настоящее время не систематизированы и разрознены. Имеются сообщения о наличии в моче ВК-полиомавирусов, цитомегаловирусов (ЦМВ) и аденовируса у больных с геморрагическим циститом после аллогенной трансплантации костного мозга и пересадки почек [6-8]. Для правильной интерпретации полученных результатов по обнаружению каких-либо таксонов вирусов в моче, необходимо знать не только микробиоту мочи в норме, но и частоту присутствия вирусов. Цель исследования: изучить вирусно-бактериальные ассоциации в моче здоровых людей. 

Материалы и методы

Обследованы 20 здоровых сексуально активных женщин и мужчин, которые по гендерному признаку разделены на равнозначные группы: I группа – здоровые женщины (n=10), II группа – здоровые мужчины (n=10). Возраст обследуемых колебался от 20 до 25 лет, средний возраст составил 22,4 +- 1,2 года.

Критерии включения групп в исследование: возраст до 25 лет, отсутствие гинекологических заболеваний в I группе, урологических заболеваний – в I и II группах, заболеваний, передающихся половым путем как в анамнезе, так и на момент исследования, отсутствие инфекционных, генетических, аутоиммунных заболеваний, а также факторов риска (радиоактивное облучение и т.д.), отсутствие патологических изменений почек, мочевой системы, внутренних половых органов при ультразвуковом исследовании, приема различных препаратов (антибиотиков, кортикостероидов) последние 2 месяца, а также противозачаточных – в I группе, формально нормативные показатели общего анализа крови и мочи, согласие обследуемых на участие в исследовании.

Из исследования исключались мужчины с ранее диагностированным крипторхизмом и орхитом. В обеих группах на исследование забирали среднюю порцию утренней мочи после соответствующей гигиенической процедуры при самостоятельном мочеиспускании обследуемых в стерильный пластиковый контейнер (Sterile Uricol for urine sample collecƟ on «HiMedia»). Пробы мочи кодировали идентификационным номером и разделяли на 3 аликвоты: 1 – для проведения общего анализа мочи, 2 – для бактериологического исследования, 3 – для проведения ПЦР. Бактериологическое исследование мочи проводили в соответствии с Клиническими рекомендациями («Бактериологический анализ мочи» (2014)).

Помимо питательных сред, регламентированных в Клинических рекомендациях, использовали дополнительные хромогенные среды «HiMedia» для культивирования факультативно-анаэробных (ФАБ) и неклостридиальных анаэробных бактерий (НАБ). Соответственно использовали аэробные и анаэробные условия культивирования. Идентификацию выделенных микроорганизмов проводили по общепринятым признакам (морфо-тинкториальным, культуральным, биохимическим).

В моче определяли присутствие ДНК папилломавирусов человека (HPV), вирусов простого герпеса I и II типов (HSV I и II), цитомегаловирусов (CMV), вирусов Эпштейна-Барр (EBV) с помощью стандартной ПЦР, используя коммерческие ПЦР-диагностические наборы производства АО «Дон-технологи», «Литех» (Москва). Статистические расчёты выполняли в R (версия 3.2, R FoundaƟ on for StaƟ sƟ cal CompuƟ ng, Vienna, Austria). Различия анализировали на основе оценок частот встречаемости и концентраций. Для анализа сходства использовали метод Варда (расстояние БреяКёртиса). Средние значения представлены в виде Медиана [Нижний квартиль; Верхний квартиль].

Таблица 1. Микробиота мочи
Table 1. Microbiota of urine

Результаты

При бактериологическом исследовании мочи стерильные посевы отсутствовали. Во всех случаях микроорганизмы, верифицированные в моче здоровых людей, регистрировали в составе аэробно-анаэробных ассоциаций (от 3- до 7-компонентных). В моче обследуемых I и II групп доминировали 3-компонентные ассоциации (40,0% и 30,0% соответственно). В кластере ФАБ (табл. 1) в обеих группах доминировали коагулаза-отрицательные стафилококки (КОС) (90,0 и 80,0% соответственно). Однако, видовой спектр КОС был шире в I группе и представлен 5 видами (S. epidermidis (40,0%), S. xylosus (20,0%), S. haemolyƟ cus, S. saprophyƟ cus, S warneri (по 10,0%). Во II группе паттерн КОС включал 3 вида с доминированием S. haemolyƟ cus (40,0%), реже из мочи выделяли S. epidermidis (30,0%) и S. saprophyƟ cus (10,0%).

Представители семейства Enterobacteriaceae регистрировали в моче в 20,0% случаев в I группе и в 10,0% – во II группе. Во всех случаях из мочи выделяли банальные E. coli в незначительном количестве (табл. 1). Enterococcus spp. чаще регистрировали в моче мужчин (60,0%), их паттерн был представлен E. faecalis (30,0%), E. faecium (30,0%) и недифференцированными видами (20,0%). В моче обследуемых I группы обнаруживали только E. faecium. При анализе таскономической структуры НАБ, выделенных из мочи обнаружена следующая тенденция (табл. 1): в моче здоровых женщин доминировали Lactobacillus spp. (90,0%), Peptococcus spp. (80,0%), Propionibacterium spp. (70,0%), а в моче здоровых мужчин – Eubacterium spp. (70,0%) и Peptostreptococcus spp. (40,0%).

Дрожжеподобные грибы рода Candida, выделенные из мочи женщин были представлены C. tropicalis (20,0%) и C. albicans (10,0%). Средние уровни бактериурии для большинства таксонов ФАБ и НАБ составили 102 КОЕ/мл. При проведении ПЦР мочи папилломные и герпетические вирусы регистрировали в 40,0% случаев в обеих группах (30,0% – в I группе, 10,0% – во II группе). В I группе верифицированы HPV (20,0%) и HSVII (10,0%), во II группе – только HPV (10,0%). Во всех случаях при обнаружении вирусов в моче их регистрировали в составе вирусо-бактериальных ассоциаций. У одной здоровой женщины (10,0%) в моче обнаружены ассоциации HPV+HSVII.

Обсуждение

Понимание того, как развиваются микробиота и виробиота мочи у здоровых людей под действием разнообразных факторов является важным для будущих исследований. Потому, что эти исследования являются основой в интерпретации результатов бактериологического и вирусологического исследований при различных урологических заболеваниях. Они могут влиять на патогенетические механизмы, клинику, исход урологических заболеваний и открывать новые перспективы в лечении [9, 10]. Ряд наших, ранее опубликованных исследований свидетельствуют о том, что в моче пациентов с инфекциями верхних и нижних мочевых путей чаще регистрируется аэробная-анаэробная микст-инфекция [11-16]. Аналогичная картина наблюдаются в моче здоровых людей.

В обследованных группах ПЦР мочи показал наличие ДНК папилломавируса и вируса простого герпеса 2 типа (HSVII) в 30% и 10% случаев, соответственно. Наличие вирусной инфекции в моче было также продемонстрировано в исследовании о роли ВПЧ как высокого, так и низкого риска в генезе хронического рецидивирующего цистита у женщин [17]. Santiago-Rodriguez TM et al. в своем исследовании показали, что моча, как здоровых субъектов, так и с инфекцией мочевых путей (ИМП) имеет свои виромы, а ВПЧ является частью вирома мочи у 95% исследуемых субъектов, как мужчин, так и женщин [3, 10].

В моче человека могут присутствовать аденовирусы, полиомавирусы, которые являются патогенными в основном для лиц с иммунодефицитом и перенесших трансплантацию почек, костного мозга [8, 18]. Для характеристики мочевого микробиома ряд исследователей применяли метод секвенирования гена 16S рРНК, используя образцы мочи как от здоровых людей, так и от пациентов с ИМП, инфекциями, передаваемыми половым путём и различными заболеваниями верхних мочевых путей. Однако метод метагеномного секвенирования гена 16S рРНК имеет одно существенное ограничение, которое заключается в невозможности дифференцировки между живыми и мертвыми бактериями [19-21].

В нашем исследовании при использовании расширенного набора питательных сред с учётом аэробной и анаэробной методик культивирования мы показали, что в моче здоровых женщин доминируют Lactobacillus spp. (90,0%), Peptococcus spp. (80,0%), Propionibacterium spp. (70,0%), а в моче здоровых мужчин – Eubacterium spp. (70,0%) и Peptostreptococcus spp. (40,0%). Fouts DE et al. при изучении гендерных различий микробиома в средней порции мочи, используя метод секвенирования гена 16S рРНК пришли к выводу, что у женщин преобладают Lactobacillales spp., а у мужчин Corynebacterim spp. [22]. 

Выводы

Данные о верификации различных таксонов вирусов в моче здоровых людей являются основой для понимания и детализации этиологической структуры ИМП, решения вопроса о необходимости включения верификации различных таксонов вирусов при ИМП, особенно в ситуациях с относительным «бактериальным благополучием» при бактериологическом исследовании мочи и разработке подходов к персонализированной терапии. Дальнейшие исследования должны быть направлены на увеличение когорты обследуемых здоровых людей для получения корректной фактограммы бактериальных и вирусных паттернов, присутствующих в моче здоровых людей.

Литература

1. Thomas-White K, Brady M, Wolfe AJ, Mueller ER. The bladder is not sterile: history and current discoveries on the urinary microbiome. Curr Bladder Dysfunct Rep. 2016;11(1):18–24. DOI: 10.1007/s11884-016-0345-8
2. Kogan MI, Naboka YL, Ibishev KS, Gudima IA, Naber KG.Human urine is not sterile – shiŌ of paradigm. Urol Int. 2015;94(4):445-52. DOI: 10.1159/000369631
3. Santiago-Rodriguez TM, Ly M, Bonilla N, Pride DT. The human urine virome in association with urinary tract infections. Front Microbiol. 2015;6:14. DOI: 10.3389/fmicb.2015.00014
4. Wolfe AJ, Toh E, Shibata N, Rong R, Kenton K, Fitzgerald M, Mueller ER, Schreckenberger P, Dong Q, Nelson DE, Brubaker L. Evidence of uncultivated bacteria in the adult female bladder. J Clin Microbiol. 2012 A;50(4):1376-83. DOI: 10.1128/JCM.05852-11
5. Nelson DE, Dong Q, Van der Pol B, Toh E, Fan B, Katz BP, Mi D, Rong R, Weinstock GM, Sodergren E, Fortenberry JD. Bacterial communities of the coronal sulcus and distal urethra of adolescent males. PLoS One. 2012;7(5):e36298. DOI: 10.1371/journal.pone.0036298
6. Coomes EA, Wolfe Jacques A, Michelis FV, Kim DDH, Thyagu S, Viswabandya A, Lipton JH, Messner HA, Deotare U. Efficacy of Cidofovir in Treatment of BK Virus-Induced Hemorrhagic Cystitis in Allogeneic Hematopoietic Cell Transplant Recipients. Biol Blood Marrow Transplant. 2018;24(9):1901-1905. DOI: 10.1016/j.bbmt.2018.04.009
7. Helanterä I, Hirsch HH, Wernli M, Ortiz F, Lempinen M, Räisänen-Sokolowski A, Auvinen E, Mannonen L, Lautenschlager I. Simultaneous BK Polyomavirus (BKPyV)- associated nephropathy and hemorrhagic cystitis after living donor kidney transplantation. J Clin Virol. 2016;76:4- 7. DOI: 10.1016/j.jcv.2015.12.008
8. Dosin G, Aoun F, El Rassy E, Assi T, Lewalle P, Blanc J, van Velthoven R, Bron D. Viral-induced Hemorrhagic Cystitis After Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant. Clin Lymphoma Myeloma Leuk. 2017;17(7):438-442. DOI: 10.1016/j.clml.2017.05.013
9. Whiteside SA, Razvi H, Dave S, Reid G, Burton JP. The microbiome of the urinary tract–a role beyond infection. Nat Rev Urol. 2015;12(2):81-90. DOI: 10.1038/nrurol.2014.361
10. Santiago-Rodriguez TM. Identification and Quantification of DNA Viral Populations in Human Urine Using NextGeneration Sequencing Approaches. Methods Mol Biol. 2018;1838:191-200. DOI: 10.1007/978-1-4939-8682-8_14
11. Набока Ю.Л., Гудима И.А., Мирошничнко Е.А. Коган М. И., Ибишев X.С., Васильева Л.И. Этиологическая структура и антибиотикочувствительность уропатогенов при хронической рецидивирующей инфекции нижних мочевых путей. Урология. 2011;6:12-15.
12. Набока Ю.Л., Коган М.И., Васильева Л.И., Гудима И.А., Мирошниченко Е.А., Ибишев Х.С. Бактериальная микстинфекция у женщин с хроническим рецидивирующим циститом. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2011;1:8–12.
13. Набока Ю.Л., Гудима И.А., Коган М.И., Ибишев Х.С., Черницкая М.Л. Микробный спектр мочи и биоптатов мочевого пузыря у женщин с хроническим рецидивирующим циститом. Урология. 2013;4:16-18.
14. Ибишев Х.С. Некоторые аспекты лечения персистирующей инфекции нижних мочевыводящих путей у женщин. Урология. 2014;5:30-34.
15. Набока Ю.Л., Гудима И.А. Коган М.И., Черницкая М.Л. Микробный спектр мочи молодых здоровых женщин. Урология. 2010;5:7-10.
16. Коган М.И., Набока Ю.Л., Гудима И.А., Газаев З.И., Ибишев Х.С., Митусова Е.В. Новый взгляд на этиологическуюструктуру острого обструктивного пиелонефрита. Современные проблемы науки и образования. 2012;4:68. Доступно по: http://science-education.ru/ru/article/ view?id=6878 Ссылка активна на 01.08.2018.
17. Ибишев Х.С., Крахоткин Д.В., Васильев А.А., Крайний П.А. Рецидивирующая инфекция нижних мочевых путей вирусной этиологии. Вестник урологии. 2017;5(1):26-31. DOI: 10.21886/2308-6424-2017-5-1-26-31
18. Masutani K. Viral infecƟ ons directly involved in kidney allograŌ funcƟ on. Nephrology (Carlton). 2018;23 Suppl 2:31- 37. DOI: 10.1111/nep.13285
19. Siddiqui H, Nederbragt AJ, Lagesen K, Jeansson SL, Jakobsen KS. Assessing diversity of the female urine microbiota by high throughput sequencing of 16S rDNA amplicons. BMC Microbiol. 2011;11:244. DOI: 10.1186/1471-2180-11-244
20. Hilt EE, McKinley K, Pearce MM, Rosenfeld AB, Zilliox MJ, Mueller ER, Brubaker L, Gai X, Wolfe AJ, Schreckenberger PC. Urine is not sterile: use of enhanced urine culture techniques to detect resident bacterial flora in the adult female bladder. J Clin Microbiol. 2014;52(3):871-6. DOI: 10.1128/JCM.02876-13. Epub 2013 Dec 26
21. Gottschick C, Deng ZL, Vital M, Masur C, Abels C, Pieper DH, Wagner-Döbler I. The urinary microbiota of men and women and its changes in women during bacterial vaginosis and antibiotic treatment. Microbiome. 2017;5(1):99. DOI: 10.1186/s40168-017-0305-3
22. Fouts DE, Pieper R, Szpakowski S, Pohl H, Knoblach S, Suh MJ, Huang ST, Ljungberg I, Sprague BM, Lucas SK, Torralba M, Nelson KE, Groah SL. Integrated next-generation sequencing of 16S rDNA and metaproteomics differentiate the healthy urine microbiome from asymptomatic bacteriuria in neuropathic bladder associated with spinal cord injury. J Transl Med. 2012;10:174. DOI: 10.1186/1479-5876-10-174