Разработка лабораторной технологии получения клеточной (эритроцитарной) формы цефтриаксона и экспериментальное обоснование целесообразности ее использования при необструктивном пиелонефрите

• Братчиков О.И. – д.м.н., профессор, заведующий кафедрой урологии КГМУ Минздрава России, Курск, Россия, bratov45@mail.ru, AuthorID 189415
• Сипливый Г.В. – д.м.н., профессор кафедры урологии КГМУ Минздрава России, Курск, Россия, SiplivyjGV@kursksmu.net, AuthorID 436207
• Ипатов В.Ю. – аспирант кафедры урологии КГМУ Минздрава России, Курск, Россия Ipatov V. Yu. – postgraduate student at the Department of Urology KSMU of Ministry of Heal
• Безъязычная А.А. – аспирант кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии КГМУ Минздрава России, Курск, Россия, AuthorID 894770
• Кукурека А.В. – к.фарм.н., доцент кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии КГМУ Минздрава России, Курск, Россия, KukurekaAV@kursksmu.net, AuthorID 359995
• Сипливая Л.Е. – д.б.н., профессор, заведующий кафедрой фармацевтической, токсикологической и аналитической химии КГМУ Минздрава России, Курск, Россия, farmchim@rambler.ru, AuthorID 558776

Цефтриаксон является антибиотиком группы цефалоспоринов третьего поколения, при внутримышечном или внутривенном введении он длительно сохраняется в организме и хорошо проникает в органы. Однако применение цефтриаксона может вызывать аллергические реакции, изменение формулы крови, нарушение функции печени и почек и, в связи с этим, применение его в условиях инфекционных воспалительных заболеваний почек, и в частности пиелонефрита, может привести к нежелательным последствиям.

Направленный транспорт лекарственных средств в охваченную патологическим процессом зону позволяет наряду с созданием в ней высокой концентрации препарата максимально снизить нежелательные реакции организма на медикаментозное воздействие, снизить терапевтическую дозу препарата и кратность введения. Реализация идеи направленного транспорта лекарств идет по линии использования клеток крови в качестве контейнеров для доставки лекарственных средств [1-3].

Цель работы. Разработать систему доставки цефтриаксона с использованием эритроцитарных векторов при необструктивном пиелонефрите для его селективного воздействия на орган с целью повышения эффективности и снижения токсичности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперимент выполнен на беспородных крысах массой 190-220 г. Все исследования проводились в одинаковых климатических условиях с использованием стандартного пищевого режима вивария. Животных отбирали по возрасту и по массе, разброс которой был в пределах 10%. Экспериментальные крысы при проведении исследований разделили на группы по 8-9 животных. При выполнении эксперимента соблюдались гуманные принципы конвенции по работе с лабораторными животными (Франция 1986 г.).

Инфекционное поражение почек (необструктивный пиелонефрит) моделировали по методике Ю.М. Есилевского, путем внутрибрюшинного введения арахидоновой кислоты в дозе 2,5 мг/кг ежедневно в течение 10 дней, на 10-е сутки внутривенно вводили взвесь культуры кишечной палочки [4]. О состоянии выделительной функции почек судили по концентрации мочевины и креатинина в крови [5]. Активность ферментов в почках и количество клеток крови оценивали по методике В.В. Меньшикова [5]. В ходе приготовления гистологических препаратов использовалась окраска гематоксилином и эозином.

В качестве системы доставки препарата в почки использовали аллогенные эритроциты. Для иммобилизации цефтриаксона в тени эритроцитов использовали метод гипоосмотического гемолиза, позволяющий ввести максимально возможное количество препаратов [6,7].

Для получения аллогенных эритроцитов использовали 3 мл крови. После оседания эритроцитов удаляли плазму вместе с лейкоцитарной пленкой. Эритроциты крыс, выделенные из 3 мл крови, дважды отмывали изотоническим раствором натрия хлорида путем центрифугирования при 500 g в течение 5 мин при 4°С. Осадок эритроцитов гемолизировали семикратным объемом охлажденной до 0°С воды, очищенной и центрифугировали при 1500 g в течение 25 мин. К полученной строме приливали пятикратный объем цефтриаксона, растворенного в охлажденной до 5°С воде очищенной. Концентрация препарата в инкубационной среде соответствовала его разовой дозе в пересчете на крысу. Взвесь инкубировали в течение 20 мин при 4°С, затем добавляли 1/10 объема 10% натрия хлорида для восстановления целостности стромы и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. После включения препаратов в стромальные сферы последние дважды отмывали изотоническим раствором натрия хлорида, затем осаждали при 1500 g в течение 10 мин (эритроцитарная форма).Количественную оценку цефтриаксона проводили в соответствии с нормативной документацией методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. В работе использовали цефтриаксон (Индия) в виде раствора для инъекций.

Цефтриаксон и его эритроцитарную форму вводили внутривенно, при этом использовали аллогенный перенос клеток. Препарат вводили в дозах, соответствующих рекомендованным терапевтическим дозам, пересчитанным с учетом соотношения поверхности тела биологического объекта и его массы по общепринятой формуле межвидового переноса доз с применением коэффициента пересчета в зависимости от массы тела. Антибиотики вводили в хвостовую вену без наркоза. Крысу помещали в специально сконструированную установку. Стеклянная коническая конструкция позволяла фиксировать крысу, при этом хвост находился вне установки. Перед введением препаратов хвост разогревали обработкой водой с повышенной температурой и этанолом. Для прокола хрящевого панциря использовали тонкую иглу и для точного дозирования применяли инсулиновый шприц.

Статистическую обработку результатов исследования проводили путем вычисления средних арифметических изучаемых показателей (M) и их стандартных ошибок (m). Существенность различий средних величин оценивали по критериям Стьюдента и Вилкоксона-Манна-Уитни [8,9].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для отработки лабораторной технологии получения эритроцитарной формы цефтриаксона изучены особенности его включения в эритроцитарные носители (ЭН) здоровых животных и животных с пиелонефритом. С этой целью ЭН здоровых крыс и крыс с пиелонефритом инкубировали с раствором препарата, содержащим 1 и 2 г цефтриаксона, в течение 10, 30 и 60 мин при 4oС. Вначале инкубацию проводили с меньшей концентрацией, а затем концентрацию препарата в инкубационной жидкости увеличивали в два раза. Устойчивость ЭН на десорбцию и выделение препарата из ЭН определяли путем двукратного предварительного отмывания и инкубации их в аутологичной плазме при 37oС в течение 30 мин

Было установлено, что в ЭН здоровых доноров включается цефтриаксона 23,1%, а в ЭН крыс с пиелонефритом – 21,8%. Полученные результаты показывают, что антибиотик в примерно равной степени включаются в ЭН как здоровых, так и крыс с пиелонефритом. Изучение процессов десорбции цефтриаксона из ЭН в плазму крови показало их достаточную устойчивость и тем самым подтвердило возможность использования эритроцитов для направленного транспорта антибактериального препарата.

Установлено, что введение арахидоновой кислоты совместно с микробным агентом вызывало развитие пиелонефрита, подтверждающееся клиническими показателями: повышение температуры, снижение веса на 10% (табл. 1). Анализ выделительной функции почек показал повышение уровня в крови мочевины в 1,9 раза и креатинина в – 3,0 раза, появление лейкоцитов и белка в моче (табл. 2).

Таблица 1. Изменение температуры и массы тела у животных с необструктивным пиелонефритом

Таблица 2. Уровень мочевины и креатинина у животных с необструктивным пиелонефритом

Примечание * – достоверность различий между группами (p ≤ 0,05)

Установлено изменение лейкоцитарной формулы крови: увеличение количества лейкоцитов на 25%, уменьшение количества лимфоцитов на 20% и повышение количества нейтрофилов на 21%. В почках отмечено снижение активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в 1,7 раза,глютаматдегидрогеназы (ГДГ) – в 1,9 раза, щелочной фосфатазы (ЩФ) – в 2,1 раза, на фоне высокой активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Анализ патологических изменений в мозговом слое почек показал очаговые некрозы и очаговые скопления лейкоцитов.

Полученные результаты свидетельствовали о развитии инфекционного воспалительного процесса в почках, весьма близкого к естественной картине пиелонефрита.

Для сравнительной оценки эффективности свободной и клеточной формы цефтриаксона при экспериментальном пиелонефрите использовали внутривенное введение разовых доз препаратов, пересчитанных по общепринятой методике на крысу. При этом температуру тела определяли один раз в сутки в одно и то же время (9 – 10 ч) до ее полной нормализации и последующие два дня, выделительную функцию почек и массу тела определяли на четвертый и последующие дни. Лабораторные показатели определяли во всех группах на 10 сутки после развития пиелонефрита

Установлено, что пятикратное введение животным с пиелонефритом цефтриаксона в дозе 20 мг/кг и 10 мг/кг, нормализовало температуру тела на 10-12-е сутки, выделительную функцию почек на 12-14 сутки, соответственно, при этом вес животных достоверно не изменялся. На 10-е сутки в крови количество лейкоцитов было повышено в среднем на 10-12%, количество лимфоцитов снижено на 8-9%, количество нейтрофилов не изменялось, уменьшался, но не нормализовался дисбаланс активности ферментов в почках.

В отличие от этого однократное введение крысам с пиелонефритом эритроцитарной формы цефтриаксона в разовой дозе и дозе в два раза меньшей (20 мг/кг; 10 мг/кг) нормализовало температуру тела на 5 – 6 и 6 – 7 сутки, соответственно, выделительную функцию почек на 5-6 и 6-7 сутки, на 10 сутки отмечена полная нормализация количества лейкоцитов, лимфоцитов, нейтрофилов в крови, активности ферментов в почках.

ОБСУЖДЕНИЕ

Нами разработана лабораторная технология получения эритроцитарной формы цефтриаксона, включающая выделение ЭН, получение стандартизованной по количеству действующего вещества клеточной формы антибактериального препарата.

Установленыособенности включения цефтриаксона в эритроцитарные носители здоровых животных и крыс с пиелонефритом. Показано, что примерно равное включение цефтриаксона происходит при использовании эритроцитарных носителей здоровых крыс и крыс с пиелонефритом, что дает возможность избежать использования донорской крови. Установлена достаточная устойчивость эритроцитарных носителей с включенным цефтриаксоном, что позволяет их использовать в качестве контейнеров для направленного транспорта антибиотика в органы и, в частности, в почки.

Общеизвестно, что инфекционный воспалительный процесс в почках возникает при попадании микробного агента на фоне нарушения уро- или гемодинамики почек [4]. Экспериментальный пиелонефрит моделировали введением токсического и микробного агентов: арахидоновой кислоты и кишечной палочки. Развитие экспериментального пиелонефрита подтверждалось клиническими показателями (гипертермия, снижение веса, нарушение выделительной активности), изменение лейкоцитарной формулы, появлением в почках микроабсцессов из скопления лейкоцитов, разбалансированием активности почечных ферментов. Механизм развития пиелонефрита в выбранной модели, повидимому, можно объяснить нарушением внутрипочечного кровотока, который возникает за счет повреждающего действия на почечную ткань (арахидоновая кислота), что приводит к фиксации микроорганизмов в почках. Оценка эффективности свободной и клеточной форм цефтриаксона при экспериментальном пиелонефрите показало, что введение эритроцитарной формы, в соответствующих его системному введению дозах, оказывало более существенный фармакологический эффект, что выражалось в более ранней нормализации (5-7 сутки) клинических, лабораторных, гематологических и морфологических показателей.

Таким образом, была разработана система доставки цефтриаксона с использованием эритроцитарных носителей при необструктивном пиелонефрите.

ВЫВОДЫ

1. Экспериментальное моделирование пиелонефрита подтверждено развитием клинических, лабораторных, гематологических признаков воспалительного процесса в почках, снижением в почках активности СДГ, ГДГ, ЩФ в 1,7 – 2,1 раза на фоне высокой активности ЛДГ.
2. Системное введение цефтриаксона (20 мг/кг) 1 раз в сутки курсом 5 дней после моделирования пиелонефрита нормализовало температуру тела, выделительную функцию, стабилизировало гематологические показатели, уменьшался дисбаланс активности ферментов и морфологические показатели в почках к 10-12 суткам наблюдения.
3. Однократное введение эритроцитарной формы цефтриаксона в дозе, соответствующей его системному однократному введению (20 мг/кг) и в дозе в два раза меньшей, оказывало более существенный фармакологический эффект по сравнению с традиционным способом, что выражалось в более ранней нормализации (на 5 – 7 сутки) клинических, лабораторных, морфологических показателей.

ЛИТЕРАТУРА

1. Сагитова Д.С., Мухиддинов Н.Д., Веселов Ю.Е. Направленный транспорт лекарственно модифицированных элементов крови в профилактике и лечении осложнений острого панкреатита воспалительной и травматической этиологии. Здравоохранение Таджикистана 2008;(1-2):22-26.
2. Братчиков О.И. Иммуномодулирующая, гепатопротекторная и антиоксидантная активность иммобилизированных форм аминогликозидных антибиотиков при токсическом поражении почек, осложненном стафилококковой инфекцией. Урология 2008;5:8-11.
3. Vitvitsky V.M. Anion permeability and erythrocyte swelling. Bioelectrochemistry 2000;52(2):169-176.
4. Есилевский Ю. М. Патогенез пиелонефрита. М.: МЕДпресс-информ, 2007; 368 с.
5. Меньшиков В. В. Лабораторные методы исследования в клинике: справочник. М.: Медицина, 1987; 365 с.
6. Генинг Т.П., Колкер И. И., Жумадилов Ж. Ш. Использование форменных элементов крови для направленной доставки химиотерапевтических и диагностических препаратов в очаг поражения. Антибиотики и химиотерапия 1988;33(11):867-870.
7. Жумадилов Ж. Ш., Макаренкова Р. В. Особенности включения некоторых антибиотиков в эритроцитарные тени – систему целенаправленной доставки химиотерапевтических препаратов. Антибиотики и химиотерапия 1990;35(11):54-56.
8. Гублер Б.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. Л.: Медицина, 1978; 294 с.
9. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1980; 293 с.

Статья опубликована в журнале “Экспериментальная и клиническая урология” №2 2019 г., стр. 34-37