Функциональное состояние клеточных мембран у больных мочекаменной болезнью

Голованов С.А., Просянников М.Ю., Анохин Н.В., Аполихин О.И., Сивков А.В.

Сведения об авторах:

• Голованов С.А. – д.м.н., руководитель группы клинической лабораторной диагностики НИИ урологии и интервенционной радиологии им. Н.А.Лопаткина – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, sergeygol124@mail.ru, AuthorID 636685
• Просянников М.Ю. – к.м.н., зав. отделом мочекаменной болезни НИИ урологии и интервенционной радиологии им. Н.А. Лопаткина – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, prosyannikov@gmail.com, AuthorID 791050
• Анохин Н.В. – к.м.н., младший научный сотрудник отдела мочекаменной болезни НИИ урологии и интервенционной радиологии им. Н.А. Лопаткина – филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, anokhinnikolay@yandex.ru, AuthorID 880749
• Сивков А.В. – к.м.н., заместитель директора научно-исследовательского института урологии и интервенционной радиологии им. Н.А. Лопаткина -филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, uroinfo@yandex.ru, AuthorID 622663
• Аполихин О.И. – д.м.н., профессор, член-корреспондент РАН, .директор НИИ урологии и интервенционной радиологии им. Н.А. Лопаткина – филиала ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, sekr.urology@gmail.com, AuthorID 683661

По современным представлениям инициация процессов камнеобразования в основном зависит от двух основных факторов: наличия бляшки/пробки Рэндалла в паренхиме почки и соотношения в моче литогенных соединений (метаболических факторов риска), ингибиторов и промоторов процессов кристаллои камнеобразования [1]. В конечном счете, химический состав мочи является интегральным результатом процессов избирательного транспорта, протекающего в мембранах клеток тубулярного эпителия почек. В связи с этим исследование свойств мембранного аппарата клеток эпителия канальцев имеет существенное значение для выяснения особенностей патогенеза мочекаменной болезни (МКБ).

С другой стороны, само образование камней в мочевых путях часто сопровождается нарушением уродинамики. Это способствует возникновению микроциркуляторных расстройств, развитию дистрофических и воспалительных процессов в почечной ткани, нарушению структуры и функции клеточных мембран [2].

Одним из ключевых механизмов повреждения клеток, в том числе гипоксического или воспалительного характера, считают свободнорадикальное окисление и, в частности, перекисное окисление липидов (ПОЛ) цитомембран [3]. Между клеточными мембранами и внеклеточной средой происходит непрерывный обмен веществ, поэтому мембраны клеток способны, с одной стороны, определять характер метаболизма в целом, а с другой – служить своеобразным отражением его состояния, его обобщенным критерием. Очевидно также, что по комплексу биохимических параметров плазмы или мочи можно судить о состоянии мембранного аппарата клеток. Сказанное относится, по-видимому, ко всем типам клеточных мембран, включая почечные, постоянно контактирующие с канальцевой жидкостью и плазмой крови. Однако данных о том, в какой степени состояние клеточных мембран при МКБ способно отражать характер системного метаболизма не имеется.

В связи с этим, в отдельной серии исследований была сделана попытка выявить связь между функциональным состоянием клеток, точнее, физико-химическим состоянием их мембран, и метаболическими показателями мочи и крови у больных уролитиазом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе исследованы данные 68 человек, из которых 35 пациентов (19 мужчин и 16 женщин) в возрасте от 23 до 61 лет с диагнозом МКБ, хронический пиелонефрит в стадии ремиссии. В качестве контроля исследовали мочу (33 человека) и кровь (15 человек) практически здоровых людей.

Продукты ПОЛ определяли в плазме крови, в мембранах эритроцитов и моче больных. Активность процессов ПОЛ оценивали по уровню первичных (диеновые конъюгаты) и вторичных (малоновый диальдегид) продуктов липидной пероксидации. Кроме того, выполнялся комплекс исследований для определения известных клинико-биохимических показателей (клиренса креатинина, мочевины, креатинина, электролитов, концентрации кальция, мочевой кислоты, фосфатов крови и их экскреции с мочой и других).

Для поиска связи между физико-химическим состоянием мембран клеток крови и метаболическими показателями мочи и крови у больных уролитиазом использовали мембранный флюоресцентный зонд пирен [4], который включали в гидрофобную липидную часть мембраны изолированных лимфоцитов крови [5] больных МКБ.

Исследование интенсивности флюоресценции мембранных зондов выполняли на флюоресцентном спектрофотометре Hitachi 650-10 S (Япония).

Взвесь лимфоцитов крови выделяли центрифугированием в градиенте фиколла-верографина [6]. Однородность клеточного состава контролировали микроскопически. Гидрофобный зонд пирен добавляли к взвеси лимфоцитов крови до конечной концентрации 5 мкм на 5∙106 клеток. Принцип метода флюоресцентных зондов основан на том, что спектр и интенсивность флюоресценции встроенных в мембрану молекул некоторых химических соединений (зондов) меняются в зависимости от физико-химического состояния клеточных мембран.

Параметры микровязкости и полярности микроокружения мембранных липидов оценивали с помощью гидрофобного зонда пирена («зонда на липиды»). Метод основан на явлении эксимеризации встроенного в биомембрану пирена. Интенсивность флюоресценции в мембране возбужденных димеров (эксимеров) пирена (F470 нм) пропорциональна уменьшению микровязкости липидного микроокружения биомембраны, то есть, повышению текучести мембраны.

При этом общую микровязкость мембраны, точнее ее текучесть, оценивали как отношение интенсивностей флюоресценции эксимеров и мономеров пирена (F470нм/F393нм) при волне возбуждения 337 нм. Степень эксимеризации пирена в прибелковых зонах липидного бислоя определяется как F470 нм/F393нм при 286 нм; полярность всего бислоя – как соотношение F372 нм/F393нм при 337 нм; полярность прибелковых зон липидного бислоя мемтраны – как F372 нм/F393нм при 286 нм.

Определяли также глубину проникновения мембранных белков в липидный бислой по тушению пиреном флюоресценции триптофановых остатков белковых молекул. Параметр рассчитывается как отношение флюоресценции белков при добавлении пирена (F330нм) к исходному уровню флюоресценции мембранных белков (F330нм0 ), то есть, как F330нм/ F330нм0 и волне возбуждения 286 нм.

Полученные с помощью зондов показатели физико-химического состояния мембран лимфоцитов крови подвергали корреляционному анализу с 68 биохимическими показателями мочи и крови 24 больных МКБ.

Функциональную активность клеточных мембран активированных лейкоцитов цельной крови проводили по методу регистрации сверхслабой хемилюминисценции, описанной Ю.А. Владимировым и соавт., с использованием микрокристаллов сульфата бария [7,8].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о выраженной лейкоцитурии и десквамации тубулярного эпителия у больных МКБ. Выделение эпителиальных клеток с мочой при уролитиазе было в 2,5 раза более выраженным, чем у здоровых лиц, а лейкоцитов – в 19,5 раз (p<0,025), что указывает на наличие хронического воспалительного процесса в почечной паренхиме.

При этом значения эпителиурии и лейкоцитурии у больных также оставались высокими и составляли соответственно 0,51±0,11 и 2,71±1,31 тыс кл/мМ креатинина, по сравнению со значениями, характерными для здоровых лиц (0,16±0,04 и 0,09±0,02 тыс кл/мМ креатинина соответственно, p<0,01).

В бесклеточном супернатанте мочи больных МКБ концентрация липидов превышала нормальные значения более чем в 13 раз, увеличиваясь с 7,98±1,18 мг/л до 106,4±34,3 мг/л (p<0,005). Возможно, это является следствием процессов мембранолиза, активно протекающих в клетках почечной паренхимы при уролитиазе.

Наряду с указанными изменениями у больных уролитиазом отмечалась повышенная экскреция с мочой первичных продуктов липидной пероксидации – диеновых коньюгатов (ДК) (табл. 1). Их концентрация в моче больных более чем в 2,7 раза превышала нормальные значения, достигая 3,12±0,93 мкМ/л (p<0,05). Это свидетельствует об активации начальных этапов свободнорадикального окисления мембранных липидов в клетках тубулярного эпителия и участии липидной пероксидации в процессах нарушения структуры и функции почечной ткани при уролитиазе.

В отличие от почечной ткани характер липидной пероксидации в плазме крови имел свои особенности. Содержание малонового диальдегида (МДА) в плазме крови возрастало в 1,6 раза по сравнению с нормой, достигая значений 1,26± 0,15 мкМ/л (p<0,05).

Учитывая то, что процесс липидной пероксидации протекает в липидной фазе и непосредственно зависит от количества субстрата, рассчитывали также коэффициент «продукты ПОЛ плазмы крови/общие липиды плазмы крови». Величина этого соотношения для МДА также была высокой: содержание МДА плазмы в расчете на единицу концентрации липидов плазмы составляло 0,25±0,03 мкМ/г по сравнению со значением 0,14±0,008 мкМ/г, характерным для здоровых лиц (p<0,05). Однако уровень диеновых конъюгатов при этом заметно не изменялся.

В качестве одной из возможных причин обнаруженных сдвигов в процессах липидной пероксидации при МКБ следует рассматривать истощение различных звеньев антиоксидантных систем крови, в том числе мембранных. Исследование эритроцитарных мембран подтвердило это предположение: уровень МДА в мембранах эритроцитов крови возрастал в 1,6 раза по сравнению с нормой, достигая 6,35±0,57 мкМ/л плотно упакованных эритроцитов (p=0,01).

Обобщая результаты корреляционного анализа можно заключить, что физико-химические свойства мембран клеток крови, в данном случае лимфоцитов, способны отражать функциональное состояние мембран клеток тубулярного эпителия почек. Действительно, такие показатели почечного метаболизма, как экскреция фосфатов, оксалатов и рН мочи имеют отчетливо выраженную связь с параметрами полярности липидного бислоя и глубиной проникновения в него интегральных мембранных белков (табл. 2).

Таблица 1. Показатели перекисного окисления липидов и результаты микроскопии осадка мочи у здоровых лиц и больных МКБ

Примечание: МДА – малоновый диальдегид; ДК – диеновые конъюгаты; ОЛ – общие липиды; Р – статистический показатель достоверности различия; н.д. – не достоверно (отсутствие статистически значимого различия); n – число наблюдений в группах

Таблица 2. Коэффициенты корреляции параметров микровязкости, полярности микроокружения лимфоцитов крови и метаболических показателей при мочекаменной болезни

Примечание: коэффициенты корреляции приведены при p<0,05. Сокращения: ХС-ЛПВП – холестерин липопротеидов высокой плотности; СМ254 – среднемолекулярные токсины («средние молекулы») при спектроскопии 254 нм. Остальные сокращения те же, что и в таблице 1. * – Р=0,056; ** – P=0,078

Известно, что усиление интенсивности ПОЛ в биомембране ведет к повышению ее микровязкости за счет разрывов цепей полиненасыщенных жирных кислот в мембранных фосфолипидах [9]. Возможно, при МКБ активация свободно-радикального окисления (СРО) липидов происходит также в лимфоцитах, поскольку установлено снижение микровязкости их мембран при повышении активности ПОЛ в плазме крови и мембранах эритроцитов (R=-0,332) (табл. 2).

Еще одно подтверждение системного характера мембранных нарушений при уролитиазе было получено при исследовании функциональной активности лейкоцитов крови методом хемилюминесценции.

Обнаружено, что высота амплитуды вспышки люминесценции (h) у больных была значительно ниже, чем у здоровых лиц, составляя 4,08±0,77 против 19,1±2,64 усл. ед. (p<0,001). Поскольку интенсивность свечения зависит от количества лейкоцитов в образце крови, определяли нормированную величину хемилюминесценции, в расчете на 1000 лейкоцитов. Этот показатель также был ниже у больных уролитиазом – 1,11±0,24 усл. ед., тогда как у здоровых лиц он составлял 4,04±0,39 усл.ед. (p<0,001).

ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные данные свидетельствуют, что при МКБ наблюдается угнетение ответа фагоцитов крови на стимуляцию микрокристаллами сернокислого бария. Как известно, пусковым моментом в развитии полноценной фагоцитарной реакции является взаимодействие чужеродной поверхности с плазматической мембраной фагоцита. Принимая во внимание, сказанное ранее о развитии при уролитиазе функциональных нарушений мембран в клетках различного типа (канальцевого эпителия, эритроцитов, лимфоцитов), можно полагать, что подобные мембранные изменения возникают также и в фагоцитах крови.

Анализ полученных данных дает основание утверждать, что активация ПОЛ в плазме у больных МКБ сопровождается усиленной липидной пероксидацией в мембранах других клеток: эпителия почечных канальцев, эритроцитов, лимфоцитов и нейтрофилов крови. На это указывает также положительная корреляция между нарастанием продуктов ПОЛ в плазме крови и накоплением их в эритроцитарных мембранах, повышением экскреции продуктов липидной пероксидации с мочой, а также снижением функциональной активностью стимулированных лейкоцитов.

Таким образом, при МКБ наблюдаются множественные мембранные нарушения, которые можно рассматривать как системную мембранную патологию. Одной из причин этого является системная активация перекисного окисления липидов с вовлечением в процесс, как плазменных липидов, так и мембранных липидов клеток почечного эпителия, эритроцитов и, по-видимому, лейкоцитов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При уролитиазе можно выделить три главных патогенетических звена: активация ПОЛ – мембранные нарушения – нарушения метаболизма. Эти звенья взаимно влияют друг на друга и весьма тесно связаны между собой, поэтому их причинно-следственные отношения нуждаются в отдельном изучении. По-видимому, мембранные перестройки, возникающие в силу ряда причин, в том числе под влиянием перекисного окисления липидов, способны приводить к изменениям обмена веществ, характерным для МКБ.

Можно полагать, что перекисное окисление липидов первоначально активируется в почечной паренхиме как местный процесс, локализуясь некоторое время на клеточном или органном уровне. В дальнейшем активная липидная пероксидация может приводить к ослаблению антиоксидантной защиты организма в целом, приобретая, таким образом, системный характер. Об этом свидетельствует нарастание содержания продуктов ПОЛ в плазме крови и эритроцитарных мембранах

Пока не ясно, является ли активация ПОЛ при МКБ первичным звеном в развитии мембранной патологии или представляет собой дополнительный патогенетический фактор, поддерживающий вторичную клеточную альтерацию, воспаление и нарушение почечной функции. Этот вопрос требует дальнейшего изучения. Тем не менее, можно полагать, что в комплексном лечении МКБ определенное внимание должно быть уделено выявлению нарушений антиоксидантной системы и их коррекции.

ЛИТЕРАТУРА

1. Taylor ER, Stoller ML. Vascular theory of the formation of Randall plaques. Urolithiasis 2015; 43:41–45. doi: 10.1007/s00240-014-0718-4.
2. Просянников М.Ю., Анохин Н.В., Голованов С.А., Кирпатовский В.И., Сивков А.В., Константинова О.В., Иванов К.В., Аполихин О.И. Мочекаменная болезнь и сердечнососудистые заболевания: только статистическая связь или общность патогенетических механизмов? Экпериментальная и клиническая урология 2018;(3):34-41.
3. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., Франк Г.М. (ред.) Перекисное окисление липидов в биологических мембранах М.: Наука, 1972. 252 с.
4. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. М.: Наука. 1989. 277 с.
5. Böym A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow. Scand J Clin Lab Invest 1968. 97:7.
6. Böym A. Isolation of mononuclearcells and granulocytes from humanlood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest 1968:97:77–89.
7. Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П., Пирязев А.П. Стимулированная кристаллами сульфата бария хемилюминесценция лейкоцитов цельной крови. Биофизика 1989;XXXIV(6): 1051-1054.
8. Добрецов Г.Е., Петров В.А., Борщевская Т.А., Деев А.И., Владимиров Ю.А. Влияние перекисного окисления на физическую структуру фосфолипидных мембран. Вопросы медицинской химии. 1977;23(6):818-822.
9. Yanagawa K, Takeda H, Egashira T, Sakai K, Takasaki M, Matsumiya T. Age-related changesin alpha-tocopherol dynamics with relation to lipid hydroperoxide content and fluidity of rat erythrocyte membrane. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 1999;54(9): B379-83

Статья опубликована в журнале “Экспериментальная и клиническая урология” №2 2019 г., стр. 87-91